Цитата(leon @ 22.1.2020, 18:51)

не пора нам замахнутся на вильяма...нашего шенкспира?:)
Ну, что-же, давайте Леонид замахнёмся на Шекспира, то бишь разберёмся с челкарями, мраморами и другими фенотипами миндальной группы:Домашний сизый голубь ( Columba livia ) является ярким примером разнообразия, сформированного искусственным отбором, с множеством цветов и цветовых узоров внутри и среди более чем 350 пород. Поскольку породы домашних голубей принадлежат к одному и тому же виду и являются интерфертильными, голуби предоставляют исключительную возможность понять генетическую основу признаков пигментации, используя лабораторные скрещивания и исследования геномных ассоциаций [ 3 ]. Ранее мы определили несколько генов, участвующих в определении типа и интенсивности оперения меланинов у голубей [ 4 , 5 ], но значительно меньше известно о молекулярных детерминантах осаждения рисунка [ 6]. Молекулярная основа изменчивости паттерна является захватывающей границей в генетике пигментации, и недавняя работа с другими позвоночными обнаруживает несколько генов, которые способствуют этому процессу. Тем не менее, генетическая основа пигментной структуры определенно менее понятна, чем гены, контролирующие типы пигментов [ 7 - 16 ].
Классическая картина пигментации у C. livia, известная как Almond, вызвана полудоминантной мутацией ( St аллель) в локусе Stipper ( St ), связанном с полом [ 17 ] ( Fig. 1 ). В отличие от большинства других черт пигментного рисунка у голубей, пестрое или окропленное лоскутное одеяло из цветов оперения у миндаля, по-видимому, случайно внутри и среди особей [ 18 ]. Кроме того, цветовая картина изменяется непредсказуемым образом с каждой линькой [ 19 - 21 ]. Количество пигментированных перьев у миндальных голубей также увеличивается с каждой последующей линькой, и этот эффект более выражен у мужчин [ 22 ,23 ]. Примечательно, что это явление противоположно тому, что обычно наблюдается с признаками пигментации, которые меняются на протяжении всей жизни человека, такими как витилиго и седина, что приводит к уменьшению пигмента с течением времени [ 24 - 28 ]. Помимо миндаля, по крайней мере шесть других аллелей в St приводят к различной степени депигментации у голубей, что позволяет предположить, что локус St может быть мутационной горячей точкой [ 21 , 29 ].

Фенотипы голубей, несущих миндальные аллели ( St , Almond alle; +, аллель дикого типа). (A) гетерозиготный миндальный самец. (B) Hemizygous миндальная женщина. (С) гомозиготный миндальный самец. (D) Самки миндаля не имеют видимых дефектов глаз. (E) У гомозиготных миндальных самцов часто наблюдаются серьезные дефекты зрения. Дефекты, изображенные у этого подростка, включают вздутие век и переднюю непрозрачность. (F) Крылатые перья из разных фенотипов, слева направо: не миндаль, темный миндаль, светлый миндаль, гомозиготный миндаль.
Гетерозиготные миндальные самцы (Z St Z + ) и гемизиготные миндальные самки (Z St W; самцы - гомогаметный пол у птиц), каждая из которых имеет одну копию аллеля St , ценятся селекционерами за их привлекательные цветовые узоры. Однако гомозиготные самцы миндаля (Z St Z St ) почти всегда испытывают недостаток пигментации в первом наборе перистых перьев и имеют тяжелые врожденные дефекты глаза [ 19 , 30 , 31 ] ( Fig. 1B, C).). Модель наследования миндаля предполагает, что дозировка мутантного аллеля, а не отсутствие аллеля дикого типа, ответственна за фенотип пигмента и глаза у гомозиготных мужчин. Глазные дефекты также связаны с признаками пигментации у других видов позвоночных, включая собак и лошадей, однако молекулярная основа этих связанных эффектов остается недостаточно изученной [ 9 , 32 - 37 ]. Следовательно, миндальные голуби могут освещать связи между пигментацией и дефектами глаза, в том числе то, контролируют ли плейотропные эффекты одного гена или связанных генов с отдельными эффектами эти коррелированные признаки.
В этом исследовании мы исследуем геномную идентичность локуса St у домашних голубей. Сравнения последовательностей всего генома у миндальных и не миндальных птиц показывают вариант числа копий (CNV) у миндальных птиц, который включает полные кодирующие последовательности двух генов и частичные кодирующие последовательности двух других. Один из полных генов, Mlana , играет ключевую роль в развитии меланосомы (органеллы, в которой образуются пигментные гранулы), что делает его сильным кандидатом на фенотип пигментации, наблюдаемый у миндальных голубей. Мы также обнаружили, что разные аллели в St коррелируют с разной степенью расширения одной и той же CNV, тем самым связывая спектр вариантов пигментации с изменениями в одном локусе.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Связанная с полом область генома связана с миндальной пигментацией
Чтобы определить геномное местоположение связанного с полом локуса St , мы сравнили геномы 12 миндальных голубей с панелью из 109 не миндальных голубей из разных пород, используя вероятностную меру дифференцировки по частоте аллелей (pFst) [ 38]. ] (см. таблицу S1 для получения подробной информации). Это сканирование всего генома идентифицировало несколько значительно дифференцированных областей, но одна превосходила другие на несколько порядков и была расположена на каркасе Z-хромосомы (ScoHet5_227), как и предсказывалось в исследованиях классической генетики ( Fig. 2A ). Дифференцированная область ScoHet5_227 (положение 5,186,219-5,545,482; пик SNP, p= 1,1 e-16, порог значимости широкого генома (p = 5,5 e-10) содержал восемь аннотированных кодирующих белок генов, ни один из которых не имел фиксированных изменений кодирования в миндале по сравнению с не миндальными геномами (VAAST [ 39 ]). Следовательно, паттерн пигментации миндаля, вероятно, не является результатом несинонимичных изменений в генах, кодирующих белок.
Фигура 2.
Скачать рисунокОткрыть в новой вкладке
Фигура 2.
Миндаль связан с CNV на связанном с полом геномном каркасе. (A) Сравнение pFst всего генома между миндальными и не миндальными голубями. Каждая точка представляет позицию SNP, с оттенками серого, указывающими различные каркасы генома. Горизонтальная пунктирная серая линия обозначает порог значимости для всего генома. (B) Деталь pFst-графика для региона-кандидата на ScoHet5_227, эшафот, связанный с полом [ 104]. Генные модели изображены внизу сюжета. © Детальный вид региона CNV. Сплошная красная линия представляет среднюю нормированную глубину считывания для 10 самок миндальных птиц в этом регионе. Синяя линия является единственным представителем не миндального женского покрытия. Вертикальные пунктирные линии показывают положения точек останова CNV. Генные модели изображены ниже графика покрытия серым цветом (толстые линии, экзоны; тонкие линии, интроны).
Несколько других каркасов содержали последовательности, которые были значительно дифференцированы между миндальными и не миндальными голубями ( Fig. 2A ). Все эти области являются аутосомными, и мы предполагаем, что они связаны с другими цветовыми признаками, которые часто совместно выбираются с миндалем, чтобы дать наиболее желательную окропленную пэчворк из цветов, включая T-check (очень меланистический рисунок крыла), кайт-бронза (глубокое покраснение перьев) и рецессивный красный (феомеланическая окраска) [ 18 , 21 , 29 ]. Однако, поскольку миндаль - это признак, связанный с полом [ 17 ], мы сосредоточили наше внимание на Z-сцепленной леске ScoHet5_227.
Вариант номера копии связан с рисунком миндального пигмента
В отсутствие фиксированных изменений кодирования между миндальными и не миндальными птицами, мы затем спросили, имели ли птицы с различными фенотипами геномные структурные различия в регионе-кандидате. Мы изучили охват секвенированием на ScoHet5_227 и обнаружили, что все 12 миндальных геномов имели значительно более высокий охват в миндальной области-кандидате по сравнению с не миндальными геномами, что указывает на наличие варианта числа копий (CNV) ( Fig. 2B, C ). CNV захватывает сегмент 77-kb эталонного генома (ScoHet5_227: 5,181,467-5,259,256), с дополнительным увеличением охвата во вложенном сегменте 25-kb (ScoHet5_227: 5,201,091-5,226,635). Анализ глубины чтения подтвердил 7 копий внешнего сегмента размером 77 кб и 14 копий внутреннего сегмента размером 25 кб в геномах женщины (Z StW) Миндальные голуби, у которых St локус только на одной хромосоме. Мы использовали ПЦР для амплификации через внешние и внутренние контрольные точки CNV миндальных голубей и определили, что CNV состоит из тандемных повторов сегментов по 77 кб и вложенных сегментов по 25 кб ( рис. 3B ).
Рисунок 3
Скачать рисунокОткрыть в новой вкладке
Рисунок 3
Ассоциированная с миндалем CNV имеет сложную структуру, которая приводит к дублированию, усечению и слиянию генов. (A) Диаграмма покрытия, показывающая различные области CNV, нормализованные к области не-CNV на одном и том же каркасе. Две внешние области (1 и 3, выше график) имеют примерно 7-кратное увеличение покрытия, в то время как одна внутренняя область (2) имеет примерно 14-кратное увеличение покрытия. Генные модели изображены ниже графика покрытия серым, оранжевым и синим цветом (толстые линии, экзоны; тонкие линии, интроны). (B) Схема не миндальных (вверху) и предполагаемых миндальных (внизу) структур CNV. Структурные изменения гена в результате миндального CNV включают слияние Ermp1 и Kiaa2026 на стыке сегмента 3/1 (шестиугольник) и усеченную версию Slc16a7.на отрезке 2/2 перекрестка (звезда). Полная копия Slc16a7 встречается на каждом соединении 2/3 (ромб).
Затем мы генотипировали область CNV в более крупной выборке миндальных голубей и обнаружили значительную связь между числом тандемных повторов и фенотипом миндаля (анализ TaqMan; парный критерий Уилкоксона, p = 2,0 e-16). Почти все миндальные птицы имеют более одной копии CNV на Z-хромосому (n = 78 из 80) ( рис. 4 ). И наоборот, почти все не миндальные птицы имели только одну копию на Z-хромосому (n = 55 из 57). Две не миндальные птицы с> 1 копией на хромосому имели максимум одну дополнительную копию CNV, что указывает на то, что небольшое увеличение числа копий не обязательно вызывает фенотип миндаля. В целом, эти анализы показывают, что экспансия CNV на ScoHet5_227 связана с фенотипом миндаля.
Связанные с St фенотипы пигментации показывают количественные изменения в миндальной CNV. Черные точки представляют результаты анализа количества копий TaqMan. Средние числа копий для каждого фенотипа показаны красными точками. У большинства индивидуумов без St- связанных фенотипов ожидаемая 1 или 2 копии имеют (поскольку St - это локус, связанный с полом, у женщин минимум 1 копия, а у мужчин минимум 2). Весь другой Санкт - -связанные фенотипы связаны с расширением CNV в области кандидата на миндального строительных лесов ScoHet5_227, что указует на аллельное серии в St . Числа над каждым фенотипом указывают количество особей, отобранных.Гены внутри CNV неправильно экспрессируются в почках миндального пера
Затем мы спросили, связана ли CNV с изменениями экспрессии генов между развивающимися миндальными и не миндальными перьями. Чтобы ответить на этот вопрос, мы сравнили экспрессию генов в области CNV среди птиц с (Z St Z + , Z St W, Z St Z St ) и без (Z + Z + и Z + W) миндальных аллелей. Мы проанализировали почки миндального пера с темной и светлой пигментацией отдельно, чтобы оценить, различалась ли экспрессия между качественно различными типами пигментации пера, оба из которых присутствуют в Z St Z + и Z StW миндальные особи. CNV содержит полные кодирующие последовательности двух генов, Mlana и Slc16a7 , и частичные кодирующие последовательности двух дополнительных генов, Ermp1 и Kiaa2026 ( Fig. 3A ). Предполагается, что Mlana будет иметь до 14 полных копий на Z St хромосому на основе последовательности секвенирования у Z St W миндальных птиц ( Fig. 3B ). Млана экспрессируется почти исключительно в меланоцитах (меланин-продуцирующих клетках) и кодирует белок, который важен для созревания меланосом благодаря взаимодействию с матриксообразующим белком Pmel [ 40 - 42]. Таким образом, сочетание биологической роли Mlana и его расположения в миндальной CNV делает Mlana сильным кандидатом гена для фенотипа миндаля.
По сравнению с не миндальными перьями, экспрессия Mlana повышается в темных перьях , но не в светлых перьях, от Z St Z + и Z St W миндальных птиц или непигментированных перьевых бутонов гомозиготных миндальных (Z St Z St ) птиц. ( Рис. 5A ; см. Таблицу S2 и Таблицу S3 для необработанных данных для всех экспериментов qRT-PCR). Мы заметили, что дисперсия экспрессии наблюдается для Мланакак в темных, так и в светлых почках миндального пера, хотя и не являющихся статистически значимыми (тест Колмогорова-Смирнова), тренды выше, чем в образцах, не относящихся к миндалю. Это распределение данных может отражать изменчивость самого фенотипа, который характеризуется различными количествами и интенсивностью пигментации пера как внутри, так и между Z St Z + и Z St W миндальными голубями.
Рисунок 5
Скачать рисунокОткрыть в новой вкладке
Рисунок 5
Почки почек миндаля и миндаля имеют четкие профили экспрессии генов. (A) Экзоны, проанализированные в CNV, показывают различия экспрессии в почках миндального пера по сравнению с не миндалем. Боксовые диаграммы показывают результаты анализов qRT-PCR, разработанных для оценки экспрессии генов экзонов, расположенных в области CNV. Результаты экспрессии слитого гена получены из праймеров КПЦР, охватывающих экзон 7 Ermp1 в экзон 5 Kiaa2026.(B) Экзоны, проанализированные вне CNV, не показывают различий экспрессии в почках миндального пера по сравнению с не миндальным. Это указывает на различия в экспрессии, характерные для экзонов внутри CNV. © Экспрессия генов, связанных с меланоцитами. Результаты рт-ПЦР указывают на снижение экспрессии нескольких генов, участвующих в выработке меланина в почках миндального пера. (D) Модель взаимодействия между генами и сигнальными путями, вовлеченными в различные аспекты синтеза пигмента. Серые прямоугольники указывают пути, обсуждаемые в тексте, но не представленные непосредственно в нашем анализе выражений. NA, почечные перья у не миндальных особей с аллелями дикого типа на St; DA - почки темного миндального пера у особей гемизиготных и гетерозиготных миндалин; LA - легкие почки миндального пера у гемизиготных и гетерозиготных особей миндаля; HA, перо почки от гомозиготного миндального человека. Столбец в каждом квадрате представляет медиану, концы бокса обозначают верхний и нижний квартили, усы - самое высокое и самое низкое значение, исключая выбросы. Разные буквы обозначают группы со статистически значимыми различиями в экспрессии генов, определяемыми с помощью ANOVA и специального теста Тьюки (р <0,05).
Другие гены, полностью или частично в пределах CNV, демонстрируют повышенную экспрессию в перьях птиц с по меньшей мере одним миндальным аллелем по сравнению с не миндальными птицами. Slc16a7 кодирует монокарбоксилатный транспортер и, по прогнозам, будет амплифицирован до шести полноразмерных копий у миндальных голубей ( Fig. 3B ). Мы наблюдали 40-кратное увеличение экспрессии Slc16a7 в почках миндального пера по сравнению с не миндалем ( Fig. 5A ). Slc16a7, как известно, не важен в пигментации; однако этот ген экспрессируется у млекопитающих, где он участвует в транспорте молочной кислоты и осмотическом балансе [ 43 - 47 ].
В дополнение к двум генам, полностью содержащимся в CNV, предсказано , что новое слияние Ermp1 (ген металлопептидазы) и Kiaa2026 (неизвестная функция) охватит внешние контрольные точки CNV ( Fig. 3C ). Ни один из генов не играет роли в пигментации или развитии глаз. Предсказанный слитый белок Ermp1 / Kiaa2026 представляет собой усеченную версию Ermp1, включая пептидазный домен и 3 из 6 трансмембранных доменов ( Fig. 3B ). 22 аминокислоты из Kiaa2026 на С-конце слитого белка не включают в себя известный домен белка [ 48 ]; таким образом, слитый белок вряд ли создаст новую комбинацию функциональных доменов. Как и ожидалось, Ermp1 / Kiaa2026ген слияния не экспрессируется в перьях не миндальных птиц, но экспрессируется в птицах с миндальными аллелями ( Fig. 5A ). Когда мы проанализировали экспрессию экзонов Kiaa2026 и Ermp1, расположенных вне CNV, мы не наблюдали различий в экспрессии между генотипами ( Fig. 5B ). Таким образом, миндальный CNV связан с экспрессией нового слитого гена, но не с различиями в экспрессии полноразмерных транскриптов обоих участвующих генов. Аналогично, Ric1 , ген, находящийся непосредственно за пределами CNV, демонстрирует умеренное (менее чем в два раза) увеличение экспрессии в светлых миндальных перьях по сравнению с другими типами перьев ( Fig. 5B).). Таким образом, гены внутри CNV демонстрируют вариабельную или повышенную экспрессию в перьях миндальных птиц, тогда как гены, прилегающие к CNV, демонстрируют незначительное или нулевое изменение экспрессии.
Изменения экспрессии генов свидетельствуют о дисфункции меланоцитов в почках миндального пера
Паттерны пигментации оперения у Z St Z + , Z St W и Z St Z St Миндальные птицы радикально отличаются от не миндальных птиц, что позволило нам предположить, что другие компоненты пути меланогенеза также могут отличаться. Продукция меланина меланоцитами является многостадийным процессом, который начинается с активации нескольких путей, включая передачу сигналов Wnt и Mc1r, посредством внеклеточных лигандов и агонистов [ 49 - 52 ]. Впоследствии экспрессия транскрипционных факторов, включая Mitf, активирует генетический каскад, который в конечном итоге способствует созреванию функционального меланоцита [ 53]. Внутри самого меланоцита ряд ферментативных реакций и сборка меланосомы приводят к образованию и отложению пигментов. Меланосомы затем переносятся в клетки кожи и эпидермальные придатки, включая перья. У голубей и других птиц с пигментами на основе меланина баланс отложений феомеланина (красные, желтые) и эумеланина (черные, коричневые) определяет цвет оперения [ 54 ].
Чтобы определить, расходуются ли сигналы продукции пигмента между почками миндального и не миндального пера, мы измерили экспрессию нескольких маркерных генов для созревания и функционирования меланоцитов с помощью qRT-PCR. Сначала мы изучили гены, участвующие в выживании и дифференцировке меланоцитов, которые являются критическими ранними событиями в производстве меланина. Sox10 , который кодирует транскрипционный фактор, который активирует экспрессию многих нижестоящих генов, включая экспрессию Mitf , Tyrosinase и Tyrp1 [ 55 ], подавляется только в легких почках миндального и гомозиготного миндального пера ( Fig. 5B ). Потому что Sox10 регулирует Mitfи другие гены меланоцитов, этот результат указывает на то, что дисфункция меланоцитов возникает рано у слегка пигментированных миндальных перьев, но не у темных миндальных перьев. Второй маркерный ген дифференцировки и выживания меланоцитов, Mitf , кодирует транскрипционный фактор, который активирует экспрессию тирозиназы, Tyrp1, Pmel и Mlana [ 40 , 53 , 56 , 57 ]. В отличие от Sox10 , Mitf не дифференциально экспрессируется ни в одном из протестированных нами фенотипов ( Fig. 5C ). Этот результат предполагает, что меланоциты присутствуют в перьях всех фенотипов, даже в сильно депигментированных перьях [ 9].]. Два гена, которые активируют экспрессию Mitf ( Sox10 и Mc1r , см. Ниже; Fig. 5C ), подавлены, что означает, что Mitf также будет подавлен. Однако сохранение высокой экспрессии Mitf может быть результатом активации другими путями, такими как передача сигналов Wnt и c-Kit [ 56 ]. Вместе наши результаты экспрессии генов показывают, что меланоциты присутствуют во всех почках пера миндальных голубей ( экспрессия Mitf ), но снижается Sox10Экспрессия в светлых и гомозиготных миндальных перьях предполагает, что множественные копии миндальной CNV связаны с дисфункцией в начале меланогенеза у светлых и гомозиготных миндальных перьев ( экспрессия Sox10 снижена).
Затем мы проанализировали гены, участвующие в производстве пигмента, показатель функции меланоцитов. Mc1r , который кодирует связанный с G-белком рецептор, необходимый для выработки эумеланина [ 58 ], и тирозиназа , которая кодирует критический фермент для выработки как эумеланина, так и феомеланина, подавлялись только в гомозиготных почках миндального пера ( Fig. 5C ). Следовательно, на экспрессию двух ключевых детерминант продукции пигмента влияют только самые тяжелые фенотипы депигментации. Tyrp1 , который кодирует другой фермент, важный для эумеланина, но не для производства феномеланина [ 59], был подавлен во всех почках миндального пера, с наиболее серьезными эффектами в легких и гомозиготных почках миндального пера ( Fig. 5C ). Таким образом, путь синтеза эумеланина затрагивается во всех миндальных перьях, но на светлые миндальные и гомозиготные почки миндального пера больше влияют гены генерации пигмента и функции меланоцитов, при этом наиболее сильное подавление наблюдается у гомозигот ( рис. 5C ).
Наконец, мы измерили экспрессию гена меланосомной структуры Pmel . Считается, что структура меланосомы необходима для эумеланина, но не для производства феомеланина [ 60 ]. Pmel является амилоидным белком, который образует часть меланосомного матрикса, важного структурного компонента зрелой меланосомы [ 60 - 62 ]. Наш кандидатный ген Mlana кодирует белок, который взаимодействует с Pmel и также важен для формирования матрицы меланосом. Мы обнаружили, что Pmel подавляется во всех почках миндального пера, и наиболее сильно в двух наиболее депигментированных типах: светлый миндаль и гомозиготный миндаль ( Fig. 5C ). Как описано выше, Мланаэкспрессия увеличилась у темных миндальных перьев, но была похожа на не миндальную у светлых миндальных и гомозиготных миндальных перьев. Эти результаты трудно согласовать, потому что эти два гена регулируются Mitf. Тем не менее, наши результаты показывают, что даже пигментированные перья у миндальных птиц показывают измененную экспрессию генов пигментации.
Таким образом, в гомозиготных почках миндального пера путь производства пигментации изменяется на ранней стадии эумеланогенеза. У птиц с одной копией миндального аллеля (Z St Z + и Z St W) легкие перья демонстрируют подавление большего количества генов производства эумеланина, чем темные перья. Таким образом, фенотипически разные миндальные перья имеют различные профили экспрессии пигментных генов.
Другие аллели в локусе St являются вариантами числа копий
Классические генетические исследования указывают на множественные аллели депигментации в локусе St [ 20 , 29 , 63 , 64 ]. Чтобы определить, связана ли миндальная CNV с этими другими аллелями, мы генотипировали голубей с другими связанными с St фенотипами и обнаружили значительное увеличение числа копий в Qualmond ( St Q ; N = 10, p = 8.3e-06), Sandy ( St Sa ; N = 3, p = 3,2 e-02), блеклый ( St Fa ; N = 11, p = 5,0e-07) и Chalky ( St C ; N = 6, p= 2.7e-04) голуби по сравнению с птицами без St- связанных фенотипов ( рис. 4 , таблица S4). Другой аллель, Frosty ( St fr ), показал тенденцию увеличения числа копий, которая не достигла значимости (N = 6, p = 1). Вместе эти результаты демонстрируют, что увеличение числа копий связано с множеством аллелей депигментации в локусе St.
PS: если что не понятно по тексту, обращайтесь, по возможности - объясню.